1- DIŞKI MUAYENESİ
a) Makroskobik dışkı muayenesi: Dışkının kıvamı, rengi, miktarı ve yapısı incelenir. Dışkının kanlı, mukuslu, sulu-ishalli veya katı olup olmadığına bakılır. Dışkı örneklerinde çıplak gözle görülebilen protozoon türü olmamasına karşın, dışkının kıvamı, rengi, kokusu ve kanlı olup olmaması sindirim sisteminde yerleşen bazı protozoonlar dan (Ör. Eimeria spp., Cryptosporidium spp., Giardia ve Entamoebe gibi) şüphelenmeye olanak sağlar.
b) Kalitatif dışkı muayenesi: Mikroskobik muayenede dışkıda bulunabilen sindirim sistemine yerleşen protozoonlar aranır. Bu amaçla natif muayene, zenginleştirme metotları (flotasyon, sedimentasyon gibi) ve dışkı boyama yöntemleri kullanılır.
1- Natif Muayene:
Bu yöntemde küçük bir parça dışkı alınarak lam üzerine konulur. Üzerine bir damla fizyolojik tuzlu su (%0,9 NaCl) ilave edilerek karıştırılıp üzerine lamel kapatılıp mikroskop altında incelenir. Bu teknikte su yerine fizyolojik tuzlu su kullanılması oldukça frajil olan protozoal trophozoitlerin ozmotik basıç değişimlerine bağlı lize olmasını engeller. Bu metotta çok az miktarda dışkı örneği incelendiğinden dolayı negatif sonuçlar enfeksiyonun olmadığını göstermezken, pozitif sonuç güvenilir olup enfensiyon varlığına işaret etmektedir. Natif muyenenin bir diğer avantajı da taze dışkı örneklerinde amiplerin ve flagellalı protozoonların teşhisine olanak vermesidir.
2- Zenginleştirme Metodları:
Bu tekniklerin prensibi, yoğunluğu fazla olan yüzdürme sıvıları veya çöktürme sıvıları kullanılarak oocystleri bir arada toplayarak mikroskop altında kolayca görülmesini sağlamaktır. Yüzdürme sıvısı olarak doymuş tuzlu su, yoğun çinko sülfat veya çinko klorür solüsyonları kullanılabilir. Doymuş tuzlu su hazırlanmasında 1 litre suya 360 gr NaCl ilave edilir ve sıvının dansitesi 1,2 olur. Yoğun çinko sülfat solüsyonu 1 litre suya 703 gr ZnSO4.H2O eklenerek, çinko klorür solüsyonu ise 1 litre suya 436 gr ZnCl2 ilave edilerek hazırlanır. Her iki sıvınında dansitesi 1,3 olmalıdır.
a) Flotasyon Yöntemi ile Oocystlerin Yoğunlaştırılması:
Ceviz büyüklüğünde büyük hayvan (at, sığır) veya 3-4 kozalak küçük hayvan (koyun-keçi) dışkısı çapı 6-7 cm, yüksekliği 4-5 cm olan bir kaba alınır. Üzerine kabın yarısına kadar olacak şekilde bir miktar doymuş tuzlu sıvı ilave edilip homojen hale getirilir. Hazırlanan karışım aynı özellikte başka bir kaba süzülür. Dışkı kabının ağzına yaklaşık 1 cm mesafe kalacak şekilde üzerine doymuş tuzlu su ilave edilir. Üzerine yüzeye paralel, yüzecek şekilde iki lamel bırakılır ve yaklaşık 20 dakika sonra bırakılan lamel düz ağızlı bir pens yardımıyla sarsmadan ve alt yüzeyinde oluşan damla düşürülmeden alınarak bir lam üzerine yerleştirilir. Preparat mikroskopta incelenir. Helmint yumurtaları 10X büyütmede aranır ve 40X büyütmeli objektifle incelenir.
b) Sedimentasyon Yöntemi ile Oocystlerin Aranması:
Bu teknikler büyük ve ağır olan trematod yumurtaları aranmasında kullanılır.
•Petri kutusunda sedimentasyon
Bir dışkı kabına 3 gr kadar dışkı konur. Üzerine çeşme suyu ilave edilerek bir bagetle iyice karıştırılarak ezilir. Karışım bir süzgeçle petri kutusuna süzülerek 15 dakika beklenir. Bu sürenin sonunda üstteki sıvı kısım dökülür. Tortu koyu olursa bu işlem bir-iki kez tekrarlanır. Sonunda dipteki tortu bir önceki metotta olduğu gibi mikroskopta incelenir.
•Teleman metodu
İnsan, maymun ve karnivor dışkısı gibi yağlı dışkıların muayenesinde uygulanan bir sedimentasyon metodudur. İncelenecek dışkının çeşitli yerlerinden mercimek tanesi büyüklüğünde 5-6 parça alınarak bir deney tüpüne konur. Üzerine 4-6 ml çeşme suyu ilave edilerek iyice ezilir. Bunun üzerine tüpteki karışım kadar % 18’lik HCl ve yine aynı miktar eter ilave edilerek iyice karıştırılır. Karışım bir santrifüj tüpüne süzülür, 1500-2000 devir/dakikada 1-2 dakika santrifüje edilir. Bu esnada tüpte üç tabaka oluşur. En üstte yağları eriten eter tabakası, ortada proteinleri eriten asit tabakası, altta su tabakası ve en dipte de helmint yumurtalarının bulunduğu tortu vardır. Üstteki tabakalar bir pipet yardımıyla dipteki tortu oynatılmadan uzaklaştırılır. Tortu hafifçe karıştırılarak alınan 1-2 damla lam üzerine konur ve lamel kapatılarak mikroskopta sistematik bir şekilde incelenir.
c) Kantitatif Dışkı Muayenesi:
Bu yöntem dışkıda görülen oocyst yada kist sayısının ve dolaylı olarak enfeksiyon şiddetinin belirlenmesinde kullanılır. Kısaca, bir miktar dışkı örneği alınarak tartılır. Daha sonra 1 gr dışkıya 15 ml su gelecek şekilde hesap edilir ve su içerisinde iyice karıştırılır. Karışımdan 0,3 ml alınarak MacMaster lamı içerisine konur ve eşit hacimde sukroz solüsyonu ile karıştırılır. Protozoon oocystleri bu sıvı içerisinde yüzerek lamın boşluğunun alt yüzeyinde toplanır. Bu yolla 0,02 gr dışkıda bulunan bütün yumurtalar bir araya toplanır ve sayımları yapılır. Sayım sonucunda çıkan rakam 50 ile çarpılarak bir gram dışkıdaki yaklaşık yumurta miktarı belirlenir. Dilüsyon yöntemi ile yapılan bu sayım enfeksiyonun düşük yoğunluklarda olduğu durumlarda çok gerçekçi sonuç verememektedir. Bu gibi durumlarda kullanılan dışkı miktarı artırılarak (10 grama kadar dışkı kullanılabilir) dışkı konsantrasyonu arttırılabilir.
2- KAN MUAYENESİ
Kan sadece kanda yaşayan parazit, protozoon ve riketsiya türlerinin teşhisi için kullanılan bir materyal olmayıp aynı zamanda birçok hastalıkta kan elementlerinde meydana gelen değişimlerin incelenerek kesin veya ayırıcı tanıya götürmede yardımcı olan hayati öneme sahip bir sıvıdır.
Hayvanlardan az miktarda kan almak için, kulak ve kuyruk ucu kullanılır. Genel traş ve temizlik sonrasında, bölge makas yardımı ile çok küçük kesilerek kanatılır. Kanama esnasında kuyruk ucu ya da kulak sıkıştırılmaz. Eğer sıkıştırma yapılırsa kan ile doku arası sıvı birbirine karışarak, kanı sulandırır ve değerlerini değiştirir. Kan almada kullanılan malzemelerin steril olması şarttır. Değişik amaçlara yönelik fazla miktarda kan alınması gerektiğinde ise venöz kan kullanılmaktadır. Hayvanlardan kan almada kullanılan iki farklı bölge kullanılmaktadır. Koyun, keçi, sığır, at ve eşeklerde en yaygın kan alma bölgesi boyun venasıdır. Tavşanlarda kulak, tavuklarda kanat venalarından veya direkt kalpten kan alınmaktadır. Kedi ve köpeklerde ise ön veya arka bacak venaları tercih edilmektedir.
Kana almak için vena üzerine uygulanacak hafif bir basınç ile kan akışı yavaşlatılarak damarın dolup şişmesi sağlanır. Damarın yeri palpasyonla tam olarak tespit edilir. Tespit edilen damara steril bir iğne ile tek hamlede girilmelidir. Damara giren iğnenin ucu yan durmalı ve damar cidarına temas ederek tıkanması engellenmelidir. Kan alımının holder adı verilen plastik malzeme ve vakumlu tüplerle yapılması kontaminasyon riskini azaltmakta ve kan alma işlemini kolaylaştırmaktadır. Yeterli kan alındıktan sonra, öncelikle damar üzerindeki basınç kaldırılır daha sonra iğne çıkartılır. Alkollü bir pamuk kısa süreli bölge üzerinde hafif basınç yaparak tutulur.
Kan örneği direkt canlıdan alınmalıdır, ancak yeni ölmüş olan hayvanlardan kan pıhtılaşmadan öncede örnek alınabilir. Kanda aranacak etkenin görülme oranı (parazitemi), parazit türüne göre farklılıklar gösteriri. Bu nedenle 8-12 saat arayla 2-3 gün süreyle kan alınarak birden fazla froti yapılması tavsiye edilir.
Kan örnekleri ile laboratuarda veya dışarıda çalışırken genel temizlik ve güvenlik kurallarına uyulmalıdır. Koruyucu eldiven ve laboratuar önlüğü giyilmeli, ellerde veya vücutta açık yara veya ezikler varsa kapatılmalıdır. İğne, lanset gibi malzemler sadece bir kez kullanılmalı ve kullanımdan sonra uygun çöp kutusuna atılmalıdır. Çalışma sonrasında eldivenler çıkarılıp, eller mutlaka yıkanmalı, laboratuar temizliği ve dekonteminasyonu (%70 etanol ya da %10 Na-hipoklorit ile) yapılmalıdır.
Kılcal (perifer-kapillar) Kan İncelenmesi;
Temiz bir lam alınarak bir kenarına cam kalemi ya da buzlu lamlarda kurşun kalem ile hasta adı veya numarası, yaşı, cinsiyeti ve tarih yazılır. Kan alınacak bölge (kuyruk ya da kulak ucu) alkol ile temizlenir ve kuruması beklenir. Bir makas ya da iğne ucu ile uç kısım hafifçe kanatılır ve ilk damla kan lam üzerine konulur. Lam üzerindeki kan kalın damla ya da yayma froti şeklinde hazırlanarak oda ısısında kurutulur. Daha sonra uygun şeklide boyanarak mikroskop altında incelenir. Eğer uygun bir laboratuar yoksa kurutulan lam bir peçete kâğıdına dikkatlice sarılarak inceleme için en yakın laboratuara en kısa sürede gönderilmelidir.
Venöz Kan İncelenmesi;
Kan alınacak bölgedeki (uygun ven bölgesi) kıllar makas yardımıyla kesilir ve alkol ile temizlenip kuruması beklenir. Steril malzemeler kullanılarak uygun şekilde ilgili bölgenin venasından anti koagulanlı tüpler (EDTA, Heparin ya da Sitrat’lı tüpler) içerisine kan alındıktan sonra permanent kalem ile hasta adı veya numarası, yaşı, cinsiyeti ve tarih yazılır. Mümkün olan en kısa zamanda laboratuara getirilen kandan bir damla alınarak temiz lam üzerine (üzerinde hayvana ait bilgilerin yazıldığı) konulup kalın damla ya da yayma froti şeklinde hazırlanarak oda ısısında kurutulur. Eğer kan örneğinin bir gün bekletilmesi gerekiyorsa mutlaka kapalı, soğutuculu kutularında saklanması gereklidir.
Kan Örneklerinin Boyanması;
Giemsa Boyama: Kan parazitlerinin aranmasında ve boyanmasında yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Kalın damla yöntemiyle hazırlanmış frotiler ya da yayma frotiler havada (oda ısısında) kurutulduktan sonra absolut metanol içerisinde 5 dakika boyunca tespit edilir. Süre sonunda froti tekrar havada kurutulur ve hazırlanmış olan giemsa boya solüsyonu içerisinde 35 dakika boyunca boyamaya bırakılır. Boyama işleminin bitiminde preparat boya solüsyonu içerisinden çıkartılarak hafif akan çeşme suyu altında fazla boyalarından arındırıldıktan sonra tekrar havada kuramaya bırakılır. Froti tamamen kuruduktan sonra immersiyon yağı damlatılıp mikroskop altında x100 objektifte incelenir.
